声明

本文是学习GB-T 33807-2017 玉米中转基因成分的测定 基因芯片法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们

1 范围

本标准规定了玉米及玉米加工产品中转基因成分的检测方法。

本标准适用于转 EPSPS 基因、PAT 基因、BAR 基因耐除草剂玉米和转 Bt
基因(CrylA105、 Cry1Ab)
抗虫玉米中转基因成分的定性检测，也适用于玉米加工产品中转基因成分的定性检测，本标准

规定的转基因成分最低检测限量是0.1%。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义

GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求

GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法

GB/T 19495.6 转基因产品检测 基因芯片检测方法

GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法

3 术语、定义和缩略语

3.1 术语和定义

GB/T 19495.1、GB/T 19495.6界定的术语和定义适用于本文件。

3.2 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BAR: 来源于杆菌 Bacillus amylolique faciens
草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl-

transferase gene)

bp:碱基对(base pair)

CaMV35S-P: 来自于花椰菜花叶病毒的35S 启动子(Promoter from cauliflower
mosaic virus)

CaMV35S-T: 来自于花椰菜花叶病毒的35S 终止子(Termination sequence from
cauliflower mo-

saic virus)

CrylAb: 苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 CrylAb 基因(Bacillus thuringiensis
Insecticidal toxin

Cry1Ab gene)

Cry1A105: 苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CrylA105 基因(Bacillus thuringiensis
Insecticidal toxin

Cry1A105 gene)

GB/T 33807—2017

dATP: 脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)

dCTP: 脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)

dGTP: 脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)

DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)

dTTP: 脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)

dUTP: 脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)

EPSPS:5-
烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate
synthase)

FMV35S-P: 玄参花叶病毒35S 启动子[promoter from Figwort mosaic
virus(FMV 35S)]

Ivrl:玉米转化酶 I 基因[Zea mays invertase(Ivrl)gene]

NC: 阴性对照(Negative control)

NOS-3': 胭脂碱合成酶基因终止子(Termination sequence of the nopaline
synthase gene)

PAT: 草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin N-acetyltransferase gene)

PC: 阳性对照(Positive control)

Taq 酶：来自于栖热水生菌的DNA 聚合酶(Thermus aquaticus DNA Polymerase)

UNG 酶：尿嘧啶-N- 糖基化酶(uracil N-glycosylase)

4 防污染措施

检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T 19495.2 的规定执行。

5 抽样与制样

抽样与制样方法应符合GB/T 19495.7 的相关规定。

6 原理

待检样品经 DNA 模板提取和核酸定量，采用多重 PCR
扩增体系，扩增其中可能含有的转基因玉 米转基因特异性扩增序列。 PCR
扩增产物与固定有目标转基因特异性探针的基因芯片进行杂交后，检

测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。

7 试剂与标准品

7.1 试剂

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。

7.1.1 玉米转基因检测膜芯片法试剂组分应符合7.1.3～7.1.22的规定。

7.1.2 试剂组分规格和存放条件参见附录 A。

7.1.3 PCR 反应使用的引物序列应符合表1的规定。

GB/T 33807—2017

表 1 PCR 反应使用的引物序列

目标基因

引物名称

序 列

扩增片段大小/bp

EPSPS

Forward

5'-GCGCGATCATACGGAAAAGAT-3'

123bp

Reverse

5'-biotin-TCGATGACTTGGCCGGTGAG-3'

PAT

Forward

5'-TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT-3'

180bp

Reverse

5'-biotin-GGCCCAGCGTAAGCAATACC-3'

BAR

Forward

5'-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3'

193bp

Reverse

5'-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3'

Cry1A105

Forward

5'-ACTCGATCAGGTACAATGCCA-3'

113bp

Reverse

5'-biotin-GCATCTGTTAGGCTCTCCAC-3'

CrylAb

Forward

5'-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3'

164bp

Reverse

5'-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3'

FMV35S-P

Forward

5'-AGTCCAAAGCCTCAACAAGG-3'

168bp

Reverse

5'-biotin-CCCACTAACTTTAAGTCTTCGGTG-3'

CaMV35S-P

Forward

5'-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3'

144bp

Reverse

5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3'

CaMV35S-T

Forward

5'-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3'

132bp

Reverse

5'-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3'

NOS-3'

Forward

5'-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3'

113bp

Reverse

5'-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3'

Ivrl

Forward

5'-GCTCCTAGCATTCCACGTCC-3'

117bp

Reverse

5'-biotin-CCCTTGTGATACAGCGGACCT-3'

7.1.4 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定。

表 2 目标基因探针序列

名称

序 列

修饰基团

EPSPS

5'-ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGC-3'

5'-AminolinkerC6

PAT

5'-GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTTGTGGCTGGTATTGCTT-3'

5'-AminolinkerC6

BAR

5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTG-3'

5'-AminolinkerC6

CrylA105

5'-GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTCTGCCCAATCTCCCATTG-3'

5'-AminolinkerC6

CrylAb

5'-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3'

5'-AminolinkerC6

FMV35S-P

5'-CAAAGTAAACTACTGTTCCAGCACATGCATCATGGTCAGTAAGTTTCAGAAAAAGACAT-3'

5'-AminolinkerC6

CaMV35S-P

5'-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3'

5'-AminolinkerC6

CaMV35S-T

5'-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3’

5'-AminolinkerC6

NOS-3'

5'-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC-3'

5'-AminolinkerC6

Ivrl

5'-AGATATTGTCCCATCAGCTGCTAGCTTTCGCGTATTGATGTCGTGACATTTTGCACGCA-3'

5'-AminolinkerC6

GB/T 33807—2017

表2(续)

名称

序列

修饰基团

PC

5'-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG-3'

5'-AminolinkerC6

NC

5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3'

5'-AminolinkerC6

注：阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo,10μmol/L):核苷酸序列与阳性对照核酸探针(PC)序列互补，用于膜

芯片杂交过程质量控制，5'端带生物素(biotin)标记，序列如下：

5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’

7.1.5 乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na,C₁₀H₁₁N₂Na₂O₈): 分析纯。

7.1.6 十二烷基磺酸钠(SDS,Ci₂H₂SO₃Na): 分析纯。

7.1.7 氢氧化钠(NaOH): 分析纯。

7.1.8 氯化钠(NaCl): 分析纯。

7.1.9 磷酸二氢钠(NaH₂PO₄ ·H₂O): 分析纯。

7.1.10 碱性磷酸酶标记链霉亲和素 (AP-streptavidin)。

7.1.11
碱性磷酸酶化学显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰(NBT/BCIP)。

7.1.12 多重 PCR 即用型预混液(Multiplex PCR Master Mix)。

7.1.13 多重PCR 引物预混液(Multiplex PCR Primer Mix):每条引物2 μmol/L。

7.1.14 20×SSPE 缓冲液：3 mol/LNaCl,200 mmol/L NaH₂PO₄ ,20 mmol/L
EDTA,pH7.4。

7.1.15 去活化液：100 mmol/L NaOH。

7.1.16 去活化清洗液：2×SSPE,0.1% SDS。

7.1.17 杂交液：2×SSPE,0.1% SDS。

7.1.18 杂交清洗液：2×SSPE,0.5% SDS。

7.1.19 酶孵育液：2×SSPE,0.5% SDS。

7.1.20 孵育清洗液1:2×SSPE,0.5% SDS。

7.1.21 孵育清洗液2:2×SSPE。

7.1.22 底物显色液：碱性磷酸酶化学显色底物 NBT/BCIP 显色液。

7.2 标准品

7.2.1 Bt11 Maize 转基因玉米标准品 Bt11 品系

Bt11 品系含待检测转基因：CrylAb,PAT,CaMV35S-P,NOS-3'。

7.2.2 CBH-351 Maize 转基因玉米标准品 CBH-351
品系

CBH-351 品系含待检测转基因：BAR,CaMV35S-P,CaMV35S-T,NOS-3'。

7.2.3 TC1507 Maize 转基因玉米标准品 TC1507
品系

TC1507 品系含待检测转基因：PAT,CaMV35S-P,CaMV35S-T。

7.2.4 MON88017 Maize 转基因玉米标准品 MON88017
品系

MON88017 品系含待检测转基因：EPSPS,CaMV35S-P,NOS-3'。

7.2.5 MON89034 Maize 转基因玉米标准品 MON89034
品系

MON89034 品系含待检测转基因：Cry1A105,FMV35S-P,CaMV35S-P,NOS-3'。

GB/T 33807—2017

7.2.6 Non-Modified Maize 非转基因玉米标准品

8 仪器与设备

8.1 基因扩增仪。

8.2 超净工作台。

8.3 消毒灭菌锅。

8.4 制冰机。

8.5 核酸蛋白分析仪。

8.6 冷藏冷冻冰箱。

8.7 纯水仪。

8.8 研磨仪。

8.9 分析天平。

8.10 膜芯片识读仪。

8.11 台式离心机：最高转速12000 r/min。

8.12 Mini 个人离心机。

8.13 涡旋混合器。

8.14 恒温水浴锅。

8.15 分子杂交炉。

8.16 膜芯片自动杂交仪。

8.17 微量移液器(量程0.2μL～2μL,1μL～10μL,20μL～100μL,100μL～1000μL)
及枪头。

9 试验方法

9.1 样品

9.1.1 实验室样品代表性应符合 GB/T 19495.7 的 规 定 。

9.1.2 标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T 19495.1 的规定执行。

9.1.3 所有测试样品的制备操作应按照 GB/T 19495.2
的规定执行，小心操作确保防止任何的污染和 样品组分的改变。

9.2 膜芯片的制作和检测步骤

9.2.1 试验用膜芯片按照附录 B 的方法进行制作。

9.2.2 膜芯片检测步骤按照附录C 进行。

9.3 样品制备

9.3.1 DNA 的提取

样品中DNA 的提取，应按照 GB/T 19495.3
中的规定执行。每个测试样品提取时应做两个重复，

并按照 GB/T 19495.3 中规定的DNA 定量方法对提取后的DNA 进行定量。

9.3.2 PCR 扩增

将9.3.1的核酸提取物加入到 PCR 反应体系进行扩增。

GB/T 33807—2017

9.3.3 PCR 反应体系

按照表3配制 PCR 反应体系。每次试验中，利用转基因玉米标准品的基因组 DNA
作为阳性质 控，非转基因玉米标准品的基因组 DNA
作为阴性质控，核酸提取空白作为空白质控，以对后续的 PCR

扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控。

表 3 PCR 反应体系体积(50μL)

反应液组成

检测反应

阳性质控

阴性质控

空白质控

Multiplex PCR Master Mix

 25 μL 25 μL

25μL

25μL

Multiplex PCR primer Mix

5μL

5μL

5μL

5μL

检测样品基因组DNA

 200 ng

转基因玉米标准品基因组DNA

 200 ng

非转基因玉米标准品基因组DNA

 200 ng

核酸提取空白

10μL

无核酸酶灭菌水

至50μL

至50μL

至50μL

至50μL

注：PCR体系最终含有MgCl₂1.5 mmol/L,dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP各0.2 mmol/L,UNG酶1U,

Taq酶2U,每条引物0.2 μmol/L。

9.3.4 PCR 反应循环参数

按照表4设计 PCR 反应参数。

表 4 PCR 反应参数

步骤

温度

反应时间

1

37℃

 10 min

2

95℃

 10 min

3

95℃

 30 s

4

55℃

 30 s

5

72℃

 30 s

3、4、5循环40次

6

72℃

 10 min

7

4℃

保温

9.4 膜芯片杂交

9.4.1 杂交体系

按照表5配制杂交体系液。

GB/T 33807—2017

表 5 杂交体系

组 分

体积/μL

杂交液(2×SSPE,0.1% SDS)

979

PCR扩增产物

20

阳性寡核苷酸单链DNA

(Positive-Oligo,10 μmol/L)

1

总体积

1.000

9.4.2 酶孵育体系

按照表6配制酶孵育体系液，用前新鲜配制。

表 6 酶孵育体系

组 分

体积/μL

孵育液(2×SSPE,0.5% SDS)

999.5

碱性磷酸酶标记链霉亲和素

(AP-streptavidin)

0.5

总体积

1000

9.4.3 杂交，酶联及显色

9.4.3.1 手动过程

将膜芯片置于杂交盒内，按表7进行手动杂交。杂交过程在分子杂交炉中进行，也可选择满足试验

要求的类似产品。

表 7 膜芯片手动杂交过程

过程名称

步 骤

去活化

加入去活化液，37℃,8min,吸除去活化液

去活化清洗

加入去活化清洗液，60℃,5min,吸除去活化清洗液

杂交

加入杂交体系液，42℃,45 min,吸除杂交体系液

杂交清洗(2次)

加入杂交清洗液，52℃,5min,吸除杂交清洗液，该过程重复2次

酶孵育

加入酶孵育体系液，42℃,30 min,吸除酶孵育体系液

孵育清洗1(2次)

加入孵育清洗液1,42℃,5min,吸除孵育清洗液1,该过程重复2次

孵育清洗2(2次)

加入孵育清洗液2,37℃,5min,吸除孵育清洗液2,该过程重复2次

显色

加入显色液，37℃,静止显色15 min,吸除显色液

显色清洗(2次)

加入去离子水，37℃,5min,吸除去离子水，该过程重复2次

结果判读

根据杂交点显色情况进行结果判读

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9.4.3.2 自动杂交仪测定过程

按膜芯片自动杂交仪操作说明书开机，预热，之后将包装有膜芯片的杂交盒放入自动杂交仪中开始

杂交过程，依次自动完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤。

具体过程如表8所示。

表 8 自动杂交仪测定过程

程序名称

试剂名称

温度/℃

时间/min

去活化

去活化液

37

8

去活化清洗

去活化清洗液

60

5

杂交

杂交液

42

45

杂交清洗

杂交清洗液

52

5

杂交清洗

杂交清洗液

52

5

酶孵育

孵育液

42

30

孵育清洗1

孵育清洗液1

42

5

孵育清洗1

孵育清洗液1

42

5

孵育清洗2

孵育清洗液2

37

5

孵育清洗2

孵育清洗液2

37

5

显色

显色液

37

15

显色清洗

去离子水

37

5

显色清洗

去离子水

37

5

结果判读

根据杂交点显色情况进行结果判读

9.5 膜芯片结果判读

9.5.1 目测判读

显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果。阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点。如果

杂交点部位没有显色，和膜芯片背景相同，则判读为阴性杂交信号。

9.5.2 膜芯片识读仪判读

膜芯片显色后，使用膜芯片识读仪进行扫描分析，根据杂交点的灰度值判断检测结果，阳性杂交信

号的判断阈值是3倍背景灰度值加上3倍背景灰度值标准差。

10 结果判断

10.1 质量控制

10.1.1 核酸提取空白对照和多重 PCR 扩增试剂空白对照

膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性，转基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳

性，阴性对照探针点杂交信号阴性。

GB/T 33807—2017

10.1.2 非转基因标准品对照

膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性，转基因探针点杂交信号阴性，阳性对照探针点杂交信号阳

性，阴性对照探针点杂交信号阴性。

10.1.3 转基因标准品对照

膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性，转基因探针点杂交信号阳性，阳性对照探针点杂交信号阳

性，阴性对照探针点杂交信号阴性。

10.1.4 质量控制原则

试验中设置10.1.1～10.1.3所述的质控对照，其膜芯片杂交检测结果应符合以上情况。如果出现

非10.1.1～10.1.3中所述的杂交结果，则应判断实验不成功，需重做试验。

10.2 结果判断

10.2.1
样本检测结果中阳性对照探针点杂交信号阴性，可初步判读膜芯片杂交过程不成功，应确认各
杂交试剂是否过期或保存条件不当，更换可疑试剂后重新试验。

10.2.2
样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性，表明未能从样本中提取出适宜多重
PCR 扩增 的核酸模板，需要重新进行样本核酸提取和多重 PCR 扩增。

10.2.3
样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性，转基因探针点杂交信号阴性，表明样本核酸提
取、多重 PCR
扩增和膜芯片杂交过程正常，判断样本中未检出测定转基因成分。

10.2.4
样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性，各转基因探针点杂交信号部分或全部阳性，表
明样本核酸提取、多重 PCR
扩增和膜芯片杂交过程正常，判读样本中存在阳性信号点对应的转基因 成分。

11 结果表述

11.1 未检出

未检出××××基因，阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常。

11.2 检出

检出××××基因，阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常。

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附 录 A

(资料性附录)

膜芯片法试剂组分的规格和存放条件

将膜芯片法所用试剂组分的规格和存放条件列于表 A.1 中 。

表 A.1 膜芯片法试剂组分规格和存放条件

序号

名 称

规格

数量

存放条件

1

多重PCR即用型预混液

 1250 μL

1管

-20℃

2

多重PCR引物预混液

250μL

1管

-20 ℃

3

无核酸酶灭菌水

 1 mL

2管

-20℃

4

转基因标准品基因组DNA(50 ng/μL)

200μL

1管

-20℃

5

阳性寡核苷酸单链DNA(Positive-Oligo,10 μmol/L)

50μL

1管

-20℃

6

去活化液

 60 mL

1瓶

室温

7

去活化清洗液

 60 mL

1瓶

室温

8

杂交液

 60 mL

1瓶

室温

9

杂交清洗液

 60 mL

2瓶

室温

10

酶孵育液

 60 mL

1瓶

室温

11

碱性磷酸酶标记的链霉亲和素

25μL

1管

 4 ℃

12

孵育清洗液1

 60 mL

2瓶

室温

13

孵育清洗液2

 60 mL

2瓶

室温

14

BCIP/NBT显色底物

 25 mL

1瓶

 4 ℃

15

膜芯片

50片

室温

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附 录 B

(规范性附录)

膜芯片制作方法

B.1 膜芯片制作

采用微定量喷点式膜芯片点样仪，将各个核苷酸探针(探针浓度25 μmol/L)
分布在带负电荷尼龙

膜芯片上的特定位置区域。芯片表面包被的探针布局如图 B.1。

杂交阳性对照：PC, 监测芯片杂交过程是否正常。

内对照：Ivr1,指膜芯片上用来质控 PCR
扩增过程是否正常的对照，使用玉米特异性内源基因 Ivr1

扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针。

阴性对照：NC, 指膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照。
一般使用一段与靶标分子序列相近

或无关的寡核苷酸作为探针。

style="width:4.86042in;height:4.18056in" />

Ivrl:玉米转化酶 I 基 因 ；EPSPS:5- 烯醇丙酮酰莽草酸-
3-磷酸合成酶；BAR: 草丁膦乙酰转移酶基因；PAT: 草 丁 膦

乙 酰 CoA 转移酶基因；Cry1A105: 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 杀 虫 毒 蛋 白
Cry1A105 基 因 ；Cry1Ab: 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 杀 虫 毒 蛋 白

CrylAb 基 因 ；FMV35S-P: 玄参花叶病毒35S 启 动 子 ；CaMV35S-P: 花 椰 菜
花 叶 病 毒 3 5S 启 动 子 ；CaMV35S-T: 花 椰 菜 花

叶病毒35S 终 止 子 ；NOS-3': 胭脂碱合成酶基因终止子；PC:
阳性对照核酸探针；NC: 阴性对照核酸探针。

图 B.1 芯片探针布局

B.2 膜芯片的质量控制

膜芯片点样后扫描无漏点、连点，位点规则，大小均匀一致，点与点的距离为300μm～500μm;
杂

交后阳性质控试验杂交信号清晰可见。

GB/T 33807—2017

附 录 C

(规范性附录)

膜芯片法检测步骤

膜芯片法检测按照图 C.1 步骤进行。

style="width:6.43403in;height:8.51389in" />

图 C.1 膜芯片法检测步骤

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